Hoja semilogaritmica de 2 ciclos pdf 37: Descarga gratuita y fácil

Para el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio y de fabricación de parenterales, una de las exigencias es la validación de los ciclos de despirogenización que se emplean. En el presente trabajo se describe la validación de un ciclo de despirogenización por calor seco en un horno de convección. En la primera etapa se estudiaron características físicas del equipo como el tiempo requerido para alcanzar la temperatura establecida, su distribución, estabilidad, y la influencia de la carga en el patrón de calentamiento. Considerando los resultados de esta fase se estableció un proceso total de 7 h a 180 ºC. La segunda etapa consistió en la determinación del grado de despirogenización retando el proceso con bioindicadores de endotoxinas. La concentración de endotoxinas en los bioindicadores control y sometidos al proceso de despirogenización se cuantificó con el empleo del ensayo del lisado de amebocitos de limulus método de gelificación. La diferencia entre el contenido de endotoxinas en el control y los tratamientos fue de 2 400 U de endotoxinas, por lo que el proceso rindió una reducción logarítmica mínima de 4,6 log, la cual es mayor que el límite de 3 log establecido por la Farmacopea de los Estados Unidos. DeCS: ENDOTOXINAS; GRADO DE CONCENTRACION; TEST DE LIMULUS.

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El acceso de las endotoxinas bacterianas a la circulación sanguínea provoca una miríada de profundas repuestas fisiológicas, en su mayoría de carácter perjudicial para la salud humana. Las endotoxinas bacterianas o pirógenos (que inducen fiebre), son lipopolisacáridos (LPS) que se localizan exclusivamente en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y poseen una alta potencia que se conserva aun después de la muerte de la bacteria.1 Los fabricantes de productos farmacéuticos parenterales y de accesorios médicos que tendrán contacto con la circulación sistémica, son responsables de asegurar que sus productos estén libres de pirógenos. El proceso de despirogenización se define como la eliminación de todas las sustancias pirogénicas incluyendo las endotoxinas bacterianas, y se logra generalmente por separación o inactivación.2 Las endotoxinas bacterianas constituyen el pirógeno más significativo y en la mayoría de las situaciones el más resistente. Puesto que las condiciones requeridas para la destrucción de endotoxinas destruirán otros pirógenos, en este tipo de estudios se acepta el término despirogenización en su generalización.3 El método clásico y más efectivo para la despirogenización de materiales termorresistentes es mediante la aplicación de calor seco en hornos y túneles de convección, conducción o radiación (infrarrojo). Clasifica entre los métodos de inactivación y se fundamenta en la destrucción térmica de las endotoxinas por incineración.4 El ciclo de despirogenización estándar es de no menos de 250 ºC por 30 min y se basa en los estudios de Welch y otros a principios de la década de los 40, quien empleó el ensayo de pirógenos en conejos para evaluar la termoestabilidad de las endotoxinas.1,2 Sin embargo, se han descrito otros ciclos como por ejemplo 180 ºC por 4 h,1,5 250 ºC por 1 h,6 190 ºC por 4 h,7 y 250 ºC por 4 h.8 Estudios de Tsuji y Harrison9 acerca de la cinética de inactivación de las endotoxinas por calor seco, demostraron que por debajo de 180 ºC la despirogenización puede ser incompleta incluso después de largos períodos. Para el estudio de los procesos de despirogenización por calor seco muchos autores han decidido importar parámetros de la validación de los procesos de esterilización; sin embargo, a diferencia con la despirogenización la temperatura y el tiempo de estos procesos son menores, además, la cinética de destrucción de los microorganismos es bastante diferente a la de las endotoxinas.10 Tsuji y Lewis11 propusieron un modelo matemático para la evaluación del proceso de inactivación de las endotoxinas por calor seco. Aunque estos resultados son prometedores, aún no están tan bien definidos como los modelos que describen la esterilización. Actualmente, la mayoría de la industria emplea un acercamiento más directo, donde la inactivación o destrucción de retos de endotoxinas se demuestra empíricamente.12 La Farmacopea de los Estados Unidos en su edición 24,13 recomienda que se incluyan retos de endotoxinas en cualquier proceso que pretenda producir artículos libres de pirógenos por calor seco. Además, especifica que dicho proceso debe demostrar una reducción de al menos 3 logaritmos en la diferencia entre el nivel recuperable de endotoxinas (control), el cual debe ser de al menos 1 000 unidades de endotoxinas (UE), y la endotoxina residual (tratamientos). Establece que los niveles de endotoxinas tienen que ser determinados con el empleo del ensayo del lisado de amebocitos de limulus (LAL). La Farmacopea de los Estados Unidos, la Europea o la Británica, por ejemplo, no describen la metodología para realizar la validación de un proceso de despirogenización por calor seco, incluso, no se refieren los otros métodos que existen. Por otra parte, la Asociación para Drogas Parenterales (Parenteral Drug Association, PDA) expone en los reportes técnicos No. 314 y No. 715 algunos aspectos a tener en cuenta a la hora de elaborar un protocolo de validación. En la literatura científica se pueden encontrar algunos trabajos que tratan este tema y podrían ayudar al buen diseño de una estrategia.3,4,10,12 ,16 El objetivo del presente trabajo es la validación de un procedimiento de despirogenización por calor seco en un horno de convección sin recirculación de aire empleado para la preparación de cristalería de laboratorio libre de pirógenos.

La temperatura no se distribuye de manera uniforme en la cámara de la estufa, se requiere mayor tiempo para alcanzar la temperatura establecida en la zona superior por lo cual es identificada como la zona fría. Este comportamiento es debido a que la resistencia de la estufa se encuentra en la parte inferior, además, un sistema sin recirculación de aire provoca cierto retardo en la homogeneización de la temperatura en la cámara por el mecanismo transferencia de calor por convección. Este comportamiento se ha descrito por Avis,18 quien demostró que existen considerables variaciones en la velocidad de calentamiento y en la temperatura alcanzada en distintos puntos del horno. Además, observó notables fluctuaciones de estos parámetros entre corridas, cuando supuestamente la estufa operaba en las mismas condiciones. Este comportamiento que él describe fue bastante similar entre un horno de convección y uno de radiaciones. Por otra parte, Gail y Jensch,19 observaron una diferencia de 3 ºC entre ámpulas y de 10-15 ºC con respecto a la temperatura del aire en un túnel de esterilización operando a 256 ºC. Esta diferencia fue menos notable a más bajas temperaturas. Considerando lo planteado en que no se contó con los accesorios necesarios para determinar con precisión el punto frío del horno, y que a menos de 180 ºC la despirogenización puede ser incompleta, es que se añadió un factor de seguridad de 7 ºC en la temperatura. Podrían plantearse otras estrategias como, por ejemplo, trabajar con ciclos de mayor temperatura y/o establecer mayor tiempo. Con el compendio de los resultados obtenidos en esta fase, se define un ciclo de despirogenización de 7 h a 187 ºC, de las cuales las 3 primeras horas cubren el tiempo necesario para que se alcance la temperatura de despirogenización establecida en la zona más fría del horno en condiciones del peor caso. Para la cuantificación de endotoxinas en cualquier muestra por el método del LAL, primeramente hay que validar el método que se emplea en dicha muestra. La metodología para la validación del método del LAL, solo se define para garantizar que se cuantifica de manera confiable la endotoxina presente en una muestra determinada.20 La guía directiva de la FDA17 y la Farmacopea de los Estados Unidos en su edición 24,13 recomiendan 2 pasos para la validación del método del LAL. Uno de ellos estriba en la evaluación del grado de inhibición que provoca determinada muestra o dilución de la muestra frente al reactivo LAL. Sin embargo, se ha planteado en la literatura que a diferencia de la manipulación necesaria para cuantificar endotoxinas en muchos productos farmacéuticos inhibidores del reactivo, los bioindicadores de endotoxinas emplean agua libre de endotoxinas (no inhibitoria), lo cual hace que no se requieran de tratamientos especiales para dichas muestras.2 Por lo tanto, no se realizó control positivo de producto para valorar el grado de inhibición en las diluciones evaluadas. Los resultados de la segunda fase de la validación del método LAL (tabla 3) confirman la sensibilidad establecida por el fabricante del juego de reactivos y, por lo tanto, demuestran que el procedimiento y las condiciones empleadas para la corrida del método fueron adecuados, lo cual asegura la cuantificación confiable de las endotoxinas presentes en las muestras. Uno de los aspectos más discutidos en la literatura ha sido el recobro de endotoxina. Se ha descrito que este depende fundamentalmente de las características del recipiente (tipo de cristal o plástico), el método para fijar o secar las endotoxinas y del método de extracción.2,3,10 En nuestro trabajo se utilizaron bioindicadores comerciales que no especifican con exactitud la potencia de la endotoxina contenida, ni proponen un método para realizar la extracción. Por lo tanto, no es posible determinar los porcentajes de recobro obtenidos con el método empleado. Sin embargo, como se obtuvo un recobro de 2 400 UE en el control, el método es adecuado para desarrollar la extracción de endotoxinas pues permite la recuperación de más de 1 000 UE/vial y determinar una reducción logarítmica de más de 3 log, aun si se empleara el método LAL menos sensible (0,12 UE/mL) con este lote de bioindicadores. El ciclo de despirogenización estudiado produjo una reducción logarítmica mínima de 4,6 log o de 40 000 veces la potencia del control, demostrando una mayor reducción que el mínimo establecido por la Farmacopea de los Estados Unidos.13 2ff7e9595c